Construido por Antonio Sillero y posteriormente por Juan Bautista de Toledo entre 1559 y 1564 como monasterio de las Clarisas, ocupa el antiguo palacio donde residieron Carlos I e Isabel de Portugal y donde nació, en 1535, su hija doña Juana, posterior fundadora del convento. Ella misma está sepultada en una capilla, con escultura funeraria orante realizada por Pompeyo Leoni.

En cuanto a su arquitectura, la fachada, de estilo plateresco, y la magnífica escalera renacentista, son los elementos originales más interesantes. El interior se reformó completamente en el siglo XVIII por Diego de Villanueva. En la clausura se conserva la estructura y muchos elementos decorativos del palacio plateresco.

En este monasterio, gestionado actualmente por Patrimonio Nacional, vivieron doña Juana y luego su hermana María, emperatriz viuda, que falleció aquí en 1603. Del siglo XVII se conservan pinturas al fresco en la escalera y en la Capilla del Milagro. 

El Monasterio ha sido catalogado como Bien de Interés Cultural.

En la visita al Monasterio de las Descalzas Reales, se tendrá la oportunidad de visitar algunos espacios cerrados a la visita del público, como la Divina Guardería, el Relicario o el sepulcro de Doña Juana de Austria.